Secara harfiah, istilah produk alami diartikan sebagai produk yang dihasilkan melalui proses tertentu secara biologi. Istilah ini dikenal dalam bahasa Inggris sebagai “natural product” yang juga menjadi salah satu bagian cabang dari ilmu kimia. Pada dasarnya, terdapat dua alasan yang mendasari mengapa para peneliti melakukan isolasi poduk alami, yaitu (1) untuk menemukan senyawa-senyawa dengan aktivitas biologi yang baik dan (2) untuk melakukan ekperimen lanjutan dengan menggunakan senyawa hasil dari proses isolasi.
Dalam proses isolasi, istilah produk alami lebih merujuk pada metabolit sekunder atau molekul-molekul kecil yang diproduksi oleh organisme tertentu dengan berat molekul kurang dari 1500 amu serta tidak sepenuhnya memiliki peran penting terhadap kelangsungan hidup organisme tersebut. Oleh karenanya, senyawa-senyawa seperti asam nukleat, protein, polisakarida, dan lain sebagainya yang merupakan bahan dasar dan penting untuk berbagai proses biologi di dalam tubuh makhluk hidup tidak menjadi target utama dari proses isolasi.
Timbul sebuah pertanyaan, “Mengapa metabolit sekunder dijadikan sebagai subtansi yang begitu penting dari proses isolasi?” Jawabannya, metabolit sekunder dipercaya memiliki sifat yang unik untuk setiap spesies dari organisme tertentu. Di antaranya memiliki peran sebagai antifeedant (zat yang dapat menghambat atau menghentikan aktivitas makan serangga), sex attractants (zat penarik pada proses perkembangbiakan), dan antibiotik. Di sisi lain, masih banyak metabolit sekunder yang belum memiliki peran biologis secara jelas sehingga perlu dikaji lebih lanjut.
Beberapa aspek yang dicapai dari proses isolasi produk alami adalah sebagai berikut:
- Menemukan senyawa baru.
- Memberikan informasi tentang kelompok senyawa yang terkandung dalam organisme tertentu.
- Mengkaji aktivitas biologi dari senyawa-senyawa yang terisolasi.
Untuk mencapai semua aspek di atas pada dasarnya senyawa yang terisolasi harus memiliki kadar kemurnian tinggi. Hal ini ditujukan untuk memperoleh hasil yang valid, baik pada proses penentuan struktur senyawa ataupun pengkajian aktivitas biologi yang mensyaratkan bebas dari kontaminasi yang dapat mempengaruhi hasil dari penentuan aktivitas tersebut.
Proses isolasi produk alami biasanya dilakukan dengan metode fraksinasi. Sebagai contoh, pada pemurnian menggunakan kolom kromatografi, sampel yang berupa campuran berbagai senyawa akan dipisahkan menjadi fraksi-fraksi yang lebih kecil sesuai dengan sifat dan karakteristiknya. Di setiap fraksi tersebut akan memiliki kadar kemurnian yang lebih baik dari sebelumnya.
Proses dilanjutkan dengan analisis setiap fraksi sebagai upaya untuk mendeteksi keberadaan senyawa yang diinginkan. Hal yang perlu diperhatikan untuk memulai isolasi produk alami adalah mengenal sifat dan karakteristik dari senyawa target yang terkandung dalam campuran atau crude extract seperti kelarutan (hidrofobisitas atau hidrofilisitas), sifat asam-basa, muatan, stabilitas pada panas, dan ukuran molekul.
Kelarutan (hidrofobisitas atau hidrofilisitas)
Penentuan kelarutan dari campuran beserta senyawa yang terkandung di dalamnya dapat dilakukan dengan tahap pengeringan dari campuran basa. Dilanjutkan dengan pelarutan kembali menggunakan beberapa jenis pelarut yang didasarkan pada urutan polaritasnya. Sebagai contoh, dimulai dengan pelarut polar sampai nonpolar: air-etil asetat-diklorometana-kloroform-n-heksana. Hasil dari tahap ini diperoleh beberapa fraksi dengan kelarutan yang berbeda-beda sesuai dengan jenis pelarutnya.
Sifat asam-basa
Rentang PH yang akan digunakan biasanya 3, 7, dan 10. Tahap ini dilakukan dengan mencampurkan larutan dari campuran atau crude extract yang mengandung air dengan satu atau dua tetes asam atau bufer dan diikuti dengan penambahan pelarut organik yang kemudian menghasilkan dua fase terpisah yaitu fase organik (ruas kiri kesetimbangan) dan fase air (ruas kanan kesetimbangan);
Pengecekan menggunakan kromatografi lapis tipis ditujukan untuk mendeteksi keberadaan dari senyawa pada kondisi asam atau basa. Prosedur ini juga memberikan informasi tentang stabilitas senyawa pada kondisi PH tertentu.
Muatan
Penentuan muatan dilakukan dengan cara mendeteksi efek dari penambahan vasiasi zat penukar ion terhadap campuran atau crude extract menggunakan sistem batch. Tahap ini juga sangat berguna dalam perancangan proses isolasi menggunakan kromatografi penukar ion.
Stabilitas terhadap panas
Pengujian ini didasarkan pada proses inkubasi campuran atau crude extract pada suhu ±90oC selama 10 menit di dalam penangas air (dengan mengamati perubahan fisik dari campuran misalnya timbul endapan, warna, atau perubahan-perubahan lainnya). Kemudian, dilanjutkan dengan pengamatan bagian-bagian dari campuran atau crude extract yang tidak terpengaruh terhadap kondisi tersebut. Metode ini dirasa sangat sulit digunakan untuk mendeteksi rusaknya senyawa dalam suatu campuran selain itu, juga dapat menyebabkan rusaknya senyawa aktif yang berdampak terhadap berkurangnya aktivitas biologis.
Ukuran molekul
Dialisis merupakan metode yang digunakan pada penentuan ukuran molekul. Proses ini akan menahan molekul-molekul yang berukuran besar/makro yang ada dalam campuran atau crude extract seperti protein di kantung membran dialisis, serta meneruskan molekul kecil (±1.500 amu) seperti metabolit sekunder.
Setelah mengetahui beberapa teknik penentuan karakteristik dari senyawa yang terkandung dalam sebuah campuran atau crude extract maka selanjutnya adalah mengetahui metode yang digunakan untuk proses isolasi yang sebagian besar didasarkan pada proses kromatografi. Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang melibatkan distribusi suatu senyawa terhadap fase gerak dan fase diam. Kromatografi yang digunakan untuk isolasi produk alami dibagi menjadi dua kategori, klasik dan modern.
Kromatografi klasik meliputi:
- Thin-layer layer chromatography (TLC)/kromatografi lapis tipis (KLT)
- Preparative thin-layer chromatography (PTLC)
- Normal-phase column chromatography (CC)
- Reverse-phase column chromatography (RP-CC)
- Sephadex column chromatography
- Flash chromatography (FC)
Kromatografi modern meliputi:
- High-performance thin-layer chromatography (HPTLC)
- Multiflash chromatography
- Vacuum liquid chromatography (VLC)
- Chromatotron
- Solid-phase extraction
- Droplet countercurrent chromatography (DCCC)
- High-performance liquid chromatography (HPLC)
- Hyphenated techniques
Putra dkk., 2019 telah berhasil mengisolasi 19 senyawa dari jamur Pseudopestalotiopsis sp. PSU-AMF45 dan 5 senyawa di antaranya merupakan senyawa baru. Penelitian tersebut dilakukan menggunakan beberapa teknik kromatografi yang dikategorikan sebagai kromatografi klasik.
Dalam penelitian tersebut juga dijelaskan bahwa kelompok senyawa yang terisolasi antara lain turunan kariofilen, kromon, makrolida ring 10, benzofenon, difenil eter, dan xanton sehingga memungkinkan untuk menemukan kelompok-kelompok senyawa tersebut dalam genus yang sama walaupun berbeda spesies. Selain itu hasil pengkajian aktivitas biologi yang dilakukan pada penelitian tersebut menyatakan bahwa beberapa senyawa uji yang terisolasi memiliki aktifitas biologi rendah terhadap jamur Candida neoformans ATCC90112.
Bahan bacaan:
- Cannell, R. J. P., 1998, Natural Products Isolation, Humana Press Inc, Totowa, New Jersey.
- Putra, H. P., Rukachaisirikul, V., Saithong, S., Phongpaichit, S., Preedanon, S., Sakayaroj, J., Hadsadee, S., Jungsuttiwong, S., 2019, Caryophyllene sesquiterpenes, chromones and 10-membered macrolides from the marine-derived fungus Pseudopestalotiopsis sp. PSU-AMF45, Tetrahedron 75 https://doi.org/10.1016/j.tet.2019.130530
- Sarker, S. D., Latif, Z., Gray, A. I., 2006, Natural Products Isolation, Humana Press Inc, Totowa, New Jersey
Penulis:
Haryadi Nugraha Putra, alumnus program magister di Prince of Songkla University, Thailand.
Kontak: haryadi.nugraha.p(at)mail.ugm.ac.id
