Mungkinkah sepotong daun yang berukuran 1×1 cm2 dapat menghasilkan puluhan tunas? Jawabannya adalah sangat mungkin. Hal tersebut dapat diwujudkan dengan menggunakan metode kultur jaringan tumbuhan. Lantas, apa yang dimaksud dengan kultur jaringan tumbuhan itu?
Kultur jaringan tumbuhan merupakan kultur aseptis sel, jaringan, atau keseluruhan tumbuhan pada kondisi nutrisi dan lingkungan yang terkendali. Penerapan metode sering kali bertujuan untuk menghasilkan klon yang true-to-type (memiliki genotipe yang sama dengan induknya). Kondisi yang terkendali memberikan lingkungan yang kondusif bagi pertumbuhan dan perbanyakan tumbuhan. Pada kondisi tersebut kebutuhan asupan nutrisi, pH media, serta faktor abiotik lain seperti suhu, kelembapan, dan cahaya harus sesuai.
Tumbuhan memiliki plastisitas perkembangan yang amat luar biasa, ditunjukkan melalui tingginya kemampuan regenerasi mereka. Dari waktu ke waktu, tumbuhan harus berhadapan dengan berbagai kerusakan fisis yang disebabkan oleh lingkungan abiotik dan biotiknya. Tumbuhan diberi kemampuan mengembangkan mekanisme pertahanan untuk menutup luka atau mengganti organ atau bagian yang rusak.
Salah satu mekanisme pertahanan ini pada tumbuhan yang berada di lingkungan alaminya ditunjukkan melalui terbentuknya kalus jika terjadi luka. Kemampuan ini diamati lebih lanjut oleh para peneliti sejak abad ke-19. Ternyata masing-masing sel pada kalus tersebut mampu menjadi individu baru jika dikultur pada media yang sesuai. Kemampuan inilah yang disebut dengan istilah “totipotensi”, yaitu kemampuan setiap sel somatik tumbuhan untuk menjadi individu baru. Kemampuan ini pula yang mengilhami para peneliti untuk mendalami potensi dan mengembangkan kultur jaringan tumbuhan.
Proses mengkultur jaringan tumbuhan harus dilakukan secara aseptis. Maksudnya, proses dilakukan secara steril dengan meniadakan keberadaan mikroba dan fungi serta menghindari kontaminasi selama proses kultur. Perlu diketahui bahwa media yang digunakan untuk kultur mengandung mineral, vitamin, dan sumber karbon seperti gula, sehingga sangat disukai oleh mikroba dan fungi. Jika media terkontaminasi, akan terjadi persaingan antara kontaminan dengan tumbuhan yang dikultur. Dalam hal ini, kultur tumbuhan akan kalah sebab laju pertumbuhan kontaminan jelas jauh lebih cepat dan terkadang mengeluarkan senyawa toksik yang menghambat pertumbuhan eksplan yang dikultur.
Adapun hal-hal yang perlu disterilisasi pada proses kultur adalah eksplan, media, alat, dan ruang kerja kultur. Perlu diingat, sterilisasi pada saat proses kultur juga harus terjaga, antara lain dengan menggunakan sarung tangan, masker, dan menyemprotkan alkohol 70% pada tangan yang digunakan untuk bekerja.
Eksplan merupakan salah satu faktor utama yang memengaruhi keberhasilan kultur jaringan tumbuhan. Eksplan ialah bagian kecil dari tumbuhan yang digunakan sebagai materi dalam kultur jaringan tumbuhan. Faktor-faktor yang menentukan respons eskplan dalam kultur jaringan adalah genotipe, tahap fisiologis tumbuhan, sumber eksplan, umur eksplan, ukuran eksplan, posisi eksplan pada tumbuhan donor, dan kerapatan eksplan pada media kultur. Segmen tumbuhan yang dapat digunakan dalam kultur adalah batang, akar, daun, bunga, ovulus, kotiledon, dan hipokotil. Eksplan-eksplan tersebut membentuk organ secara langsung ataupun tak langsung, serta membentuk embrio.
Lapisan sel yang tipis juga dapat digunakan sebagai eksplan pada beberapa spesies, seperti Begonia dan tembakau, sementara embrio dapat digunakan sebagai eksplan pada tanaman serealia (biji-bijian). Di samping itu, eksplan dari ujung tunas dan sel-sel meristematik dapat memberikan hasil yang positif untuk pembentukan kalus dan regenerasi tunas. Selain diperoleh dari tumbuhan dewasa, eksplan dapat diperoleh dari kecambah steril. Kita akan uraikan beberapa tahap dasar pada proses kultur jaringan tumbuhan.
- Persiapan media yang sesuai
Media MS, White, dan B5 adalah beberapa contoh media yang digunakan pada kultur jaringan tumbuhan. Media kultur terdiri atas nutrisi anorganik, nutrisi organik, zat pengatur tumbuh, dan agar-agar. Terdapat dua jenis nutrisi anorganik yang digunakan dalam media kultur, yaitu enam nutrisi makro (nitrogen, fosfor sulfur, kalsium, kalium, dan magnesium) dan enam nutrisi mikro (besi, molybdenum, tembaga, seng, boron, dan mangan. Sementara itu, nutrisi anorganik dapat berupa sumber karbon (sukrosa, fruktosa dan karbohidrat lain) serta vitamin dan asam amino (tiamin merupakan vitamin esensial, sedangkan inositol, piridoksin, asam nikotinat, dan asam pantotenat adalah vitamin penunjang).
Untuk zat pengatur tumbuh, beberapa contohnya adalah auksin, giberelin, sitokinin, asam absisat, dan etilen. Auksin, sitokinin, dan giberelin adalah zat pengatur tumbuh yang paling sering digunakan dalam kultur jaringan tumbuhan. Terakhir, agar-agar merupakan zat pemadat dalam media dan berperan sebagai substrat, namun tidak menambah unsur nutrisi. Agar-agar diperoleh dari rumput laut dan memberikan permukaan padat untuk pertumbuhan eksplan.
- Pemilihan eksplan
Eksplan yang digunakan sebaiknya yang muda dan sehat agar memberikan respons sesuai dengan yang diharapkan. Pada tumbuhan berkayu, eksplan yang digunakan sebaiknya berasal dari cabang yang telah dilakukan pruning (pangkas ujung).
- Sterilisasi eksplan
Eksplan disterilisasi menggunakan berbagai macam disinfektan seperti natrium hipoklorit (2%), perak nitrat (1%), kalsium hipoklorit (9-10%), larutan bromin (1-2%), merkuri klorida (0,1-1%), hidrogen peroksida, dan lain-lain. Untuk eksplan yang berasal dari tanah, misalnya umbi, terkadang memerlukan sterilisasi tambahan seperti menggunakan antifungi dan antibakteri. Setelah disterilisasi, eksplan dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali masing-masing selama lima menit untuk menghilangkan residu disinfektan pada eksplan.
- Inokulasi eksplan
Eksplan steril diinokulasikan pada permukaan media dalam kondisi aseptis dengan menggunakan laminar air flow.
- Inkubasi
Inkubasi dilakukan pada suhu 25 ± 2 oC, dengan kelembapan relatif 50–60% dan fotoperiode selama 16 jam. Bergantung pada tujuannya, untuk organogenesis, inkubasi dapat menghasilkan kalus (organogenesis tak langsung) ataupun tunas (organogenesis langsung). Jika yang dihasilkan kalus, selanjutnya dilakukan pemindahan pada media baru untuk menginisiasi terbentuknya tunas atau akar. Namun, jika yang dihasilkan tunas, dilakukan pemindahan pada media untuk menginisiasi akar. Individu tumbuhan yang memiliki akar dan tunas disebut planlet dan siap diaklimatisasi.
- Aklimatisasi
Aklimatisasi merupakan masa penyesuaian planlet pada lingkungan luar dan dilakukan secara bertahap. Setelah melewati proses ini, tumbuhan siap ditanam di lahan atau rumah kaca.
Tujuan awal kultur jaringan tumbuhan sebenarnya adalah bagian dari perbanyakan vegetatif. Dibandingkan metode perbanyakan lainnya, keunggulan menggunakan kultur jaringan tumbuhan antara lain: (1) dapat menghasilkan tumbuhan dewasa dengan cepat, (2) tidak tergantung pada biji, polinator, musim, dan lahan untuk menghasilkan banyak individu baru, (3) meminimalkan penyebaran penyakit, hama, dan patogen karena dilakukan pada kondisi steril, dan (4) memerlukan eksplan yang relatif sedikit.
Selain untuk perbanyakan tumbuhan, sebenarnya masih banyak penerapan penggunaan kultur jaringan tumbuhan dan sangat berguna dalam mendukung pengembangan bioteknologi tumbuhan. Penerapan-penerapan tersebut akan kita pelajari pada tulisan lain. Semoga bermanfaat!
Bahan bacaan:
- Feher, A. 2019. Callus, Dedifferentiation, Totipotency, Somatic Embryogenesis: What These Terms Mean in the Era of Molecular Plant Biology? Plant Sci. DOI: 10.3389/fpls.2019.00536
- Hussain, A., Qarshi, I.A., Nazir, H., & Ullah, I. 2012. Plant Tissue Culture: Current Status and Opportunities. Review Article. DOI: 10.5772/50568
- Nichodemus, C. O. 2017. Plant Tissue Culture: It’s Techniques, Applications, Advantages and Disadvantages in Plant Biotechnology. https://www.biotecharticles.com/Applications-Article/Plant-Tissue-Culture-Techniques-Applications-Advantages-and-Disadvantages-3805.html.
- Yildiz, M. 2012. The Prerequisite of the Success in Plant Tissue Culture: High Frequency Shoot Regeneration. Review Article. DOI: 10.5772/5107
- https://onlinesciencenotes.com/basic-steps-plant-tissue-culture-importance/
Penulis:
Elok Rifqi Firdiana, Peneliti di Kebun Raya Purwodadi, Pusat Penelitian Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya LIPI. Kontak: elok.firdiana(at)gmail.com
